Вплив кріопротекторів на осмотичну толерантність інтерстиціальних клітин яєчка
Анотація
Актуальність. Кріозбереження — це багатокроковий процес, який включає етапи, що механічно, осмотично та токсично впливають на біологічний матеріал. Використання кріозбереження біологічних матеріалів є економічно вигідним та забезпечує довготривале зберігання за кріогенних температур. Воно також гарантує стабільність генетичного компоненту клітин та знижує ризик контамінації біологічного матеріалу.
Мета роботи. Метою дослідження є вивчення впливу кріопротекторів (диметилсульфоксид (DMSO), декстран (D40), гідроксіетилкрохмаль, поліетиленгліколі (PEG1500 та PEG400) та фетальна бича сироватка) і їх комбінацій на взаємозв’язок між осмотичною толерантністю інтерстиціальних клітин яєчка (ІК) та кріозахистом.
Матеріали і методи. Поріг осмотичної толерантності (OTL) ІК та токсичний вплив кріопротекторів досліджували в середовищах на основі фосфатного буферного розчину з різною осмолярністю: ізоосмотичний (300 мОсм), гіпоосмотичний (225 мОсм) та гіперосмотичний (600 мОсм). Подібні осмотичні умови можуть розвиватися під час кріозбереження клітин у температурному діапазоні від +4 до -30 °C.
Результати. Показники виживання клітин після інкубації в середовищах залежали від осмолярності середовищ інкубації. Вони порівнювалися з показниками, отриманими після охолодження ІК до ‑30 °C з наступним нагріванням та видаленням кріопротекторів. Ми показали, що нетоксична добавка D40 підвищувала OTL ІК у гіпоосмотичному середовищі та зменшувала негативний вплив DMSO на клітини. Ці ефекти супроводжувалися високими показниками виживання ІК, отриманими після охолодження ІК до -30 °C у середовищі з 100 мг/мл D40 і 0,7 М DMSO.
Висновки. Ці результати розкривають механізми кріозахисту середовища 0.7DMSO+D40 і частково пояснюють перевагу цього середовища, яка була продемонстрована в наших попередніх роботах порівняно з іншими дослідженими середовищами. Розуміння механізмів кріопошкодження та кріозахисту 0.7DMSO+D40 відкриває шлях до розробки нових кріопротекторних композицій, вільних від сироватки та ксеногенних компонентів, а також покращення протоколів кріозбереження для клітинних суспензій, що включають багато типів клітин. Подальші дослідження необхідні для вивчення ефектів DMSO на мембрани та внутрішньоклітинні метаболічні процеси.
Завантаження
Посилання
Karlsson JOM, Toner M. Chapter 24 — Cryopreservation. In: Lanza RP, Langer R, Vacanti J, editors. Principles of Tissue Engineering. 2nd ed. Academic Press; 2000. p. 293–307. https://doi.org/10.1016/b978-012436630-5/50028-3
Pakhomov O, Gurina T, Mazaeva V, Polyakova A, Deng B, Legach E, Bozhok G. Phase transitions and mechanisms of cryoprotection of serum-/xeno-free media based on dextran and dimethyl sulfoxide. Cryobiology. 2022;107:13–22. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2022.06.004
Hutka M, Smith LB, Mitchell RT. Xenotransplantation as a model for human testicular development. Differentiation. 2017;97:44–53. https://doi.org/10.1016/j.diff.2017.09.001
Morrell JM, Mayer I. Reproduction biotechnologies in germplasm banking of livestock species: a review. Zygote. 2017;25(5):545–57. https://doi.org/10.1017/S0967199417000442
Schlatt S, Honaramooz A, Boiani M, Schöler HR, Dobrinski I. Progeny from sperm obtained after ectopic grafting of neonatal mouse testes. Biol Reprod. 2003;68(6):2331–5. https://doi.org/10.1095/biolreprod.102.014894
Holoch P, Wald M. Current options for preservation of fertility in the male. Fertil Steril. 2011;96(2):286–90. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2011.06.028
Kirpatovskii VI, Efremov GD, Frolova EV. Ectopic Organogenesis after Allotransplantation of Freshly Removed or Cryopreserved Neonatal Testicle under the Renal Capsule in Rats. Bull Exp Biol Med. 2018;166(2):268–73. https://doi.org/10.1007/s10517-018-4330-4
Pribor DB. PVP contrasted with dextran and a multifactor theory of cryoprotection, Cryobiology. 1974;11(1):60–72. https://doi.org/10.1016/0011-2240(74)90039-x
Dinkins MB, Brackett BG. Chlortetracycline staining patterns of frozen-thawed bull spermatozoa treated with beta-cyclodextrins, dibutyryl cAMP and progesterone. Zygote. 2000;8(3):245–56. https://doi.org/10.1017/s0967199400001040
González Hernández Y, Fischer RW. Serum-free culturing of mammalian cells--adaptation to and cryopreservation in fully defined media. ALTEX. 2007;24(2):110–6. https://doi.org/10.14573/altex.2007.2.110
Hinckley GT, Johnson CJ, Jacobson KH, Bartholomay C, McMahon KD, McKenzie D, Aiken JM, Pedersen JA. Persistence of pathogenic prion protein during simulated wastewater treatment processes. Environ Sci Technol. 2008;15;42(14):5254–9. https://doi.org/10.1021/es703186e
Pakhomov O, Shevchenko N, Chernobai N, Prokopiuk V, Yershov S, Bozhok G. Open-source hardware- and software-based cryomicroscopy system for investigation of phase transitions in cryobiological research. J Microsc. 2024;293(2):71–85. https://doi.org/10.1111/jmi.13253
Pakhomov OV, Gurina TM, Polyakova AL, Mazaeva VS, Deng B, Bozhok GA. Study of physical processes occurring in serum-containing and polymer-based serum-free cryoprotective media. Biopolym Cell. 2024;40(1):37–46. http://doi.org/10.7124/bc.000AAC
Traversari G, Delogu F, Aparicio S, Cincotti A. hMSCs in contact with DMSO for cryopreservation: Experiments and modeling of osmotic injury and cytotoxic effect. Biotechnol Bioeng. 2022;119(10):2890–907. https://doi.org/10.1002/bit.28174
Vincent C, Pickering SJ, Johnson MH, Quick SJ. Dimethylsulphoxide affects the organisation of microfilaments in the mouse oocyte. Mol Reprod Dev. 1990;26(3):227–35. https://doi.org/10.1002/mrd.1080260306
Fukui Y. Formation of multinuclear cells induced by dimethyl sulfoxide: inhibition of cytokinesis and occurrence of novel nuclear division in Dictyostelium cells. J Cell Biol. 1980;86(1):181–9. https://doi.org/10.1083/jcb.86.1.181
Gordienko EA, Pushkar NS. Physical grounds for low temperature preservation of cell suspensions. Kyiv: Naukova dumka; 1994. 143 p. (in Russian)
Klbik I. Is post-hypertonic lysis of human red blood cells caused by excessive cell volume regulation? Cryobiology. 2024;114:104795. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2023.104795
Meryman HT. The Exceeding of a Minimum Tolerable Cell Volume in Hypertonic Suspension as a Cause of Freezing Injury. In: Wolstenholme GEW, O'Connor M, editors. The Frozen Cell. CIBA Foundation Symposium. Churchill; 1970. p. 51–67. https://doi.org/10.1002/9780470719732.ch4
Traversari G, Cincotti A. Insights into the model of non-perfect osmometer cells for cryopreservation: A parametric sweep analysis. Cryobiology. 2021;100:193–211. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2020.11.013
Casula E, Traversari G, Fadda S, Klymenko OV, Kontoravdi C, Cincotti A. Modelling the osmotic behaviour of human mesenchymal stem cells. Biochem Eng J. 2019;151:107296. https://doi.org/10.1016/j.bej.2019.107296
Lemetais G, Dupont S, Beney L, Gervais P. Air-drying kinetics affect yeast membrane organization and survival. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(2):471–80. https://doi.org/10.1007/s00253-012-4014-3
Hughes ZE, Mark AE, Mancera RL. Molecular dynamics simulations of the interactions of DMSO with DPPC and DOPC phospholipid membranes. J Phys Chem B. 2012;116(39):11911–23. https://doi.org/10.1021/jp3035538
Fernández ML, Reigada R. Effects of dimethyl sulfoxide on lipid membrane electroporation. J Phys Chem B. 2014;118(31):9306–12. https://doi.org/10.1021/jp503502s
Deng B, Bondarenko T, Pakhomov O. Changes in Sexual Behavior of Orchidectomized Rats Under Influence of Allotransplantation of Testicular Interstitial Cell Suspension. Cell Transplant. 2017;26(5):795–803. https://doi.org/10.3727/096368916X693301
Doroshenko A, Posokhov E, Shershukov V, Mitina V, Ponomarev O. ChemInform Abstract: Spectral‐Luminescent Properties of 2‐Aryl (9, 10) phenanthroxazole Derivatives. Chem Inform. 1996;27(5). https://doi.org/10.1002/chin.199605028
Posokhov Y, Kyrychenko A. Location of fluorescent probes (2'-hydroxy derivatives of 2,5-diaryl-1,3-oxazole) in lipid membrane studied by fluorescence spectroscopy and molecular dynamics simulation. Biophys Chem. 2018;235:9–18. https://doi.org/10.1016/j.bpc.2018.01.005
Doroshenko AO, Posokhov E A. Proton phototransfer in a series of ortho-hydroxy derivatives of 2,5-diaryl-1,3-oxazole and 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazole in polystyrene films. Theoretical and Experimental Chemistry.1999;35(6):334–337. https://doi.org/10.1007/bf02522792
Doroshenko AO, Posokhov EA, Verezubova AA, Ptyagina LM, Skripkina VT, Shershukov VM. Radiationless deactivation of the excited phototautomer form and molecular structure of ESIPT-compounds. Photochem Photobiol Sci. 2002;1(2):92–9. https://doi.org/10.1039/b107255m
Posokhov YO, Kyrychenko A, Korniyenko Y. Derivatives of 2,5-Diaryl-1,3-Oxazole and 2,5-Diaryl-1,3,4-Oxadiazole as Environment-Sensitive Fluorescent Probes for Studies of Biological Membranes. In: Geddes C, editor. Reviews in Fluorescence 2017. Reviews in Fluorescence. Springer, Cham; 2018. p. 199–230. https://doi.org/10.1007/978-3-030-01569-5_9
Awan M, Buriak I, Fleck R, Fuller B, Goltsev A, Kerby J, Lowdell M, Mericka P, Petrenko A, Petrenko Y, Rogulska O, Stolzing A, Stacey GN. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regen Med. 2020;15(3):1463–91. https://doi.org/10.2217/rme-2019-0145
Kashuba CM, Benson JD, Critser JK. Rationally optimized cryopreservation of multiple mouse embryonic stem cell lines: I--Comparative fundamental cryobiology of multiple mouse embryonic stem cell lines and the implications for embryonic stem cell cryopreservation protocols. Cryobiology. 2014;68(2):166–75. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2013.12.007
Lovelock JE. The haemolysis of human red blood-cells by freezing and thawing. Biochim biophys acta. 1953;10(3);414–26. https://doi.org/10.1016/0006-3002(53)90273-x
Ertmer F, Oldenhof H, Schütze S, Rohn K, Wolkers WF, Sieme H. Induced sub-lethal oxidative damage affects osmotic tolerance and cryosurvival of spermatozoa. Reprod Fertil Dev. 2017;29(9):1739–50. https://doi.org/10.1071/RD16183
Collard L, Sinjab F, Notingher I. Raman Spectroscopy Study of Curvature-Mediated Lipid Packing and Sorting in Single Lipid Vesicles. Biophys J. 2019;117(9):1589–98. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2019.09.020
Dasgupta S, Auth T, Gompper G. Nano- and microparticles at fluid and biological interfaces. J Phys Condens Matter. 2017;29(37):373003. https://doi.org/10.1088/1361-648X/aa7933
Meneghel J, Kilbride P, Morris JG, Fonseca F. Physical events occurring during the cryopreservation of immortalized human T cells. PLoS One. 2019;14(5):e0217304. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217304
Cheng CY, Song J, Pas J, Meijer LH, Han S. DMSO induces dehydration near lipid membrane surfaces. Biophys J. 2015;109(2):330–9. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.06.011
Schrader AM, Cheng CY, Israelachvili JN, Han S. Communication: Contrasting effects of glycerol and DMSO on lipid membrane surface hydration dynamics and forces. J Chem Phys. 2016;145(4):041101. https://doi.org/10.1063/1.4959904
Sydykov B, Oldenhof H, de Oliveira Barros L, Sieme H, Wolkers WF. Membrane permeabilization of phosphatidylcholine liposomes induced by cryopreservation and vitrification solutions. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2018;1860(2):467–74. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.10.031
Gurtovenko AA, Anwar J. Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxide. J Phys Chem B. 2007;111(35):10453–60. https://doi.org/10.1021/jp073113e
Pakhomov O, Posokhov Y. Detecting changes of testicular interstitial cell membranes with a fluorescent probe after incubation and cryopreservation with cryoprotective agents. Cryobiology. 2025;118:105194. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2024.105194
Vitkova V, Yordanova V, Staneva G, Petkov O, Stoyanova-Ivanova A, Antonova K, Popkirov G. Dielectric Properties of Phosphatidylcholine Membranes and the Effect of Sugars. Membranes (Basel). 2021;11(11):847. https://doi.org/10.3390/membranes11110847
Cudd A, Arvinte T, Schulz B, Nicolau C. Dextran protection of erythrocytes from low-pH-induced hemolysis. FEBS Lett. 1989;250(2):293–6. https://doi.org/10.1016/0014-5793(89)80741-0
Gurina TM, Pakhomov AV, Kyryliuk AL, Bozhok GA. Development of a cryopreservation protocol for testicular interstitial cells with the account of temperature intervals for controlled cooling below -60°С. Cryobiology. 2011;62(2):107–14. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2011.01.011
Gurina TM, Pakhomov AV, Polyakova AL, Legach EI, Bozhok GA. The development of the cell cryopreservation protocol with controlled rate thawing. Cell Tissue Bank. 2016;17(2):303–16. https://doi.org/10.1007/s10561-015-9533-6
Цитування
COMPARATIVE ASSESSMENT OF DIMETHYL SULFOXIDE TOXICITY IN 2D AND 3D CULTURES OF L929 CELL LINE
Borozenets V. V (2026) Bulletin of Problems Biology and Medicine
Crossref
Авторське право (c) 2025 О. В. Пахомов, Є. О. Посохов, Н. Є. Волкова, Н. А. Чернобай, Г. А. Божок
Цю роботу ліцензовано за Міжнародня ліцензія Creative Commons Attribution 4.0.
Автори, які публікуються у цьому журналі, погоджуються з наступними умовами:
- Автори залишають за собою право на авторство своєї роботи та передають журналу право першої публікації цієї роботи на умовах ліцензії Creative Commons Attribution License, котра дозволяє іншим особам вільно розповсюджувати опубліковану роботу з обов'язковим посиланням на авторів оригінальної роботи та першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Автори мають право укладати самостійні додаткові угоди щодо неексклюзивного розповсюдження роботи у тому вигляді, в якому вона була опублікована цим журналом (наприклад, розміщувати роботу в електронному сховищі установи або публікувати у складі монографії), за умови збереження посилання на першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Політика журналу дозволяє і заохочує розміщення авторами в мережі Інтернет (наприклад, у сховищах установ або на особистих веб-сайтах) рукопису роботи, як до подання цього рукопису до редакції, так і під час його редакційного опрацювання, оскільки це сприяє виникненню продуктивної наукової дискусії та позитивно позначається на оперативності та динаміці цитування опублікованої роботи (див. The Effect of Open Access).
