Теоретичні підходи до визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів різних термінів культивування
Анотація
Актуальність. Тривимірні культуральні системи — це унікальні платформи для вивчення складних біологічних процесів in vitro. Взаємодії клітина-клітина та клітина — позаклітинний матрикс утворюють комунікаційну мережу біохімічних та механічних сигналів, що наближує сфероїди (СФ) до нативних тканин і суттєво відрізняє їх від моношарових культур. Важливим для клітинних технологій є розробка способів кріоконсервування 3D-культур, що дозволить створювати запаси цінних клітинних зразків, економити час та матеріали, буде запобігати втраті культур через технічні збої, контамінацію, дрейф фенотипу та старіння.
Мета роботи. Розробка підходів до кріоконсервування клітинних сфероїдів. Визначення параметрів проникності сфероїдів з клітин лінії L929 різних строків культивування для теоретичної оцінки оптимальних режимів заморожування.
Матеріали і методи. У роботі були використані клітини лінії L929, які утворюють СФ різного діаметру, і можуть бути підтримані тривалий час у 3D — умовах. Для визначення інтегральних коефіцієнтів фільтрації Lp і проникності для ДМСО kp у СФ на різних строках культивування, був використаний вольюмометричний метод. Дослідження динаміки зміни об’єму сфероїдів у часі здійснювали на конфокальному мікроскопі LSM 510 META. Чисельні значення інтегральних коефіцієнтів проникності СФ визначали шляхом апроксимації експериментальних даних зміни відносного об’єму СФ від часу експозиції в досліджуваному розчині теоретичними кривими, розрахованими на підставі фізико-математичної моделі пасивного масообміну між сфероїдом і оточуючим середовищем за умови їх максимального збігу. Прогнозування осмотичної поведінки СФ в умовах охолодження здійснювали на підставі диференціального рівняння, що описує кінетику зміни відносного об’єму клітини в процесі позаклітинної кристалізації кріопротекторного розчину, підставляючи в рівняння моделі визначені величини інтегральних коефіцієнтів проникності Lp і kp та енергії активації EAL і EAk. Кінетику зміни концентрації позаклітинного розчину в процесі заморожування при розрахунках задавали аналітично шляхом апроксимації фазової діаграми плавлення розчину ДМСО.
Результати. Визначені коефіцієнти фільтрації та проникності для молекул ДМСО у СФ та показано, що вони вірогідно зменшуються зі збільшенням строків культивування. Розраховані величини енергії активації проникання молекул води та ДМСО у СФ та визначена їх залежність від строків культивування. На підставі визначених параметрів проникності розрахована динаміка зміни об’єму СФ різних строків культивування за різних швидкостей охолодження.
Висновки. Теоретично визначені оптимальні режими охолодження СФ з клітин лінії L929: для 7 діб культивування — 1,5–2 °С/хв з охолодженням до -80°С і подальшим зануренням у азот; для 14 і 21 доби культивування — 0,5 °С/хв до -40°С і подальшим зануренням у азот.
Завантаження
Посилання
Woappia Y, Altomareb D, Creek K, Pirisi L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. 2020;49:102048. https://doi.org/10.1016/j.scr.2020.102048
Petrenko Y, Syková E, Kubinová Š. The therapeutic potential of three-dimensional multipotent mesenchymal stromal cell spheroids. Stem Cell Research&Therapy.2017;8:94. https://doi.org/10.1186/s13287-017-0558-6
Edmondson R, Broglie J, Adcock A, Yang L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 2014;12(4):207–218. https://doi.org/10.1089/adt.2014.573
Xu Y, Shi T, Xu A, Zhang L. 3D spheroid culture enhances survival and therapeutic capacities of MSCs injected into ischemic kidney. J Cell Mol Med. 2016;20(7):1203-1213. https://doi.org/10.1111/jcmm.12651
Seno K, Munakata Y, Sano M, et al. Aggregation of human trophoblast cells into three-dimensional culture system enhances anti-inflammatory characteristics through cytoskeleton regulation. Int J Mol Sci.2018;19:2322. https://doi.org/10.3390/ijms19082322
Baptista, LS, Kronemberger GS, Cortes I, et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. Int J Mol Sci. 2018;19:1285. https://doi.org/10.3390/ijms19051285
Dong H, Li X, Chen K, Li N, Kagami H. Cryopreserved spontaneous spheroids from compact bone-derived mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 2021;27(4):253–263. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2021.0001
Jensen C, Teng Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture?.Front Mol Biosci. 2020;7:33. https://doi.org/10.3389/fmolb.2020.00033
Griffith LG, Swartz MA. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7(3):211-224. https://doi.org/10.1038/nrm1858
Lin RZ, Chang HY. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 2008;3(9-10):1172–1184. https://doi.org/10.1002/biot.200700228
Pampaloni F, Reynaud E, Stelzer E. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8 (10): 839–845. https://doi.org/10.1038/nrm2236
Ryu N, Lee S, Park H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 2019;8(12):1620. https://doi.org/10.3390/cells8121620
Gordiyenko OI, Kovalenko SYe, Kovalenko IF, Ogurtsova VV, Todrin AF. Theoretical estimation of the optimum cooling rate of a cell suspension at linear freezing modes based on a two factor theory of cryodamage. CryoLetters. 2018;39(6):380–385.
Lee JH, Jung DH, Lee DH, Park JK, Lee SK. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplant Proc. 2012;44(4):1015–7. https://doi.org/10.1016/j.transproceed.2012.03.009
Ehrhart F, Schulz JC, Katsen-Globa A, Shirley SG, Reuter D, Bach F, at al. A comparative study of freezing single cells and spheroids: towards a new model system for optimizing freezing protocols for cryobanking of human tumours. Cryobiology. 2009;58(2):119–27. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2008.11.005
Purcell WM, Atterwill CK, Xu J. Cryopreservation of organotypic brain spheroid cultures. Altern Lab Anim. 2003 Dec; 31(6): 563–73. https://doi.org/10.1177/026119290303100605
Sundlisaeter E, Wang J, Sakariassen P, Marie M, Mathisen J, Karlsen B, at al. Primary glioma spheroids maintain tumourogenicity and essential phenotypic traits after cryopreservation. Neuropathol Appl Neurobiol.2006;32(4):419–27. https://doi.org/10.1111/j.1365-2990.2006.00744.x
Gordiyenko YeO, Gordiyenko OI, Maruschenko VV, Sakun OV. [Improved model for the passive mass transfer through the cell plasma membrane]. Biophysical bulletin. 2008;21(2);75–80. (in Ukrainian).
Tarusin DN, Kireyev VA, Kovalenko SYe, Kovalenko IF, Rozanov LF, Petrenko AYu. Selection of protocols to cryopreserve mesenchymal stromal cells in suspension and alginate microspheres by studying their osmotic responses in 1M DMSO. Problems of cryobiology and cryomedicine. 2016;26 (2):133–144. https://doi.org/10.15407/cryo26.02
Amereh M, Edwards R, Akbari M, Nadler B. In-silico modeling of tumor spheroid formation and growth. Micromachines (Basel). 2021;12(7):749. https://doi.org/10.3390/mi12070749
Netti L. Baxter Y. Boucher R. Skalak R. Jain M. Fluid тransport in living tissues: application to solid tumors. Aiche Journal. 1997;43:818–834.
Demuynck R, Efimova I, Lin A, Declercq H, Krysko D. A 3D cell death assay to quantitatively determine ferroptosis in spheroids. Cells. 2020 Mar 13; 9(3):703. https://doi.org/10.3390/cells9030703
Ogurtsova VV, Kovalenko SYe,.Kovalenko IF, Gordiyenko OI. Determination of osmotically inactive volume of murine enterocytes, Probl Cryobiol Cryomed. 2016;26(1):93-97. https://doi.org/10.15407/cryo26.01.093
Gordiyenko YeO, Pushkar NS. [Physical basis for low temperature preservation of cell suspensions]. Кyiv: Naukova dumka; 1994. 140 p. (In Russian).
Todrin OF. Popivnenko LI, Kovalenko SYE. Thermophysical properties of cryoprotectants. I. Temperature and Heat of Melting. Problems of Cryobiology. 2009;19(2):163–176
Gordienko OI, Kovalenko IF, Kovalenko SYe, Kuleshova LG, Todrin OF. Theoretical estimation of optimal linear cooling rate for PK-15 cell suspension. Probl Cryobiol Cryomed. 2021;31(3):214–222. https://doi.org/10.15407/cryo31.03
Shevchenko NA, Strybul TF, Rozanov LF. Effect of multiatom alcohols, amides and DMSO on grape and potato meristems integrity. Problems of Cryobiology. 2004;3:79–85
Achilli T-M, Meyer J, Morgan JR. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin Biol Ther. 2012;12(10):1347–60. https://doi.org/10.1517/14712598.2012.707181
Mazur P. Theoretical and experimental effects of cooling and warming velocity on the survival of frozen and thawed cells. Cryobiology. 1966;2:181–92
Chang T, Zhao G. Ice Inhibition for Cryopreservation: Materials, Strategies, and Challenges. Adv Sci (Weinh). 2021;8(6):2002425. https://doi.org/10.1002/advs.202002425
Yu G, Yap Y, Pollock K, Hubel A. Characterizing Intracellular Ice Formation of Lymphoblasts Using Low-Temperature Raman Spectroscopy. Biophys J. 2017;112(12):2653–63. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.05.009
Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells at supraoptimal rates. Cryobiology. 1977;14(2):251–72
Pegg DE. Principles of cryopreservation. Methods Mol Biol. 2015;1257:3–19. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2193-5_1
Wesley-Smith J, Walters C, Pammenter NW, Berjiak P. Why is intracellular ice lethal? A microscopical study showing evidence of programmed cell death in cryo-exposed embryonic axes of recalcitrant seeds of Acer saccharinum. Ann Bot. 2015;115(6):991–1000. https://doi.org/10.1093/aob/mcv009
Li R, Yu G., Azarin SM, Hubel A. Freezing Responses in DMSO-Based Cryopreservation of Human iPS Cells: Aggregates Versus Single Cells. Tissue Eng Part C Methods. 2018;24(5):289–99. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2017.0531
Kosheleva NV, Efremov YM, Shavkuta BS. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Sci. Rep.2020; 10:12614. https://doi.org/10.1038/s41598-020-69540-8
Автори, які публікуються у цьому журналі, погоджуються з наступними умовами:
- Автори залишають за собою право на авторство своєї роботи та передають журналу право першої публікації цієї роботи на умовах ліцензії Creative Commons Attribution License, котра дозволяє іншим особам вільно розповсюджувати опубліковану роботу з обов'язковим посиланням на авторів оригінальної роботи та першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Автори мають право укладати самостійні додаткові угоди щодо неексклюзивного розповсюдження роботи у тому вигляді, в якому вона була опублікована цим журналом (наприклад, розміщувати роботу в електронному сховищі установи або публікувати у складі монографії), за умови збереження посилання на першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Політика журналу дозволяє і заохочує розміщення авторами в мережі Інтернет (наприклад, у сховищах установ або на особистих веб-сайтах) рукопису роботи, як до подання цього рукопису до редакції, так і під час його редакційного опрацювання, оскільки це сприяє виникненню продуктивної наукової дискусії та позитивно позначається на оперативності та динаміці цитування опублікованої роботи (див. The Effect of Open Access).
