Каскадний перенос енергії в амілоїдних фібрилах інсуліну, допованих тіофлавіном Т, бензантроновим та сквараїновими барвниками

Анотація

Протестовано можливість використання трьохетапного індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) у системі зондів, що включала класичний амілоїдний маркер тіофлавін Т (ThT), бензантроновий медіатор АВМ та сквараїнові барвники SQ1, SQ4, для детектування та характеризації амілоїдних фібрил інсуліну. Виявлено високі значення ефективності багатоетапного ІРПЕ у даному ансамблі хромофорів за наявності амілоїдних фібрил інсуліну, сформованих при підвищених температурах та pH 2 (InsF1) або рН 7.4, 0.15 М NaCl (InsF2), у той час як незначний ІРПЕ спостерігали у нефібрилізованому білку (контроль), що свідчить про специфічність зондів каскаду до крос-β-складчатої архітектури амілоїдних фібрил. Зокрема, ефективність ІРПЕ для донорно-акцепторних пар ThT-ABM, ABM-SQ4 та SQ4-SQ1 за максимальної концентрації акцептора (~ 0.4 µM – 1.6 µM) становила 86%/94%, 48%/34% та 66%/8%, відповідно, у присутності InsF1/InsF2. Найбільш суттєві відмінності між InsF1/InsF2 та контрольним білком виявлено для донорно-акцепторної пари ThT-ABM, що свідчить про ключову роль АВМ як медіатора у процесі багатоетапного ІРПЕ. При оцінці відстаней між донором і акцептором у фібрилярних агрегатах InsF1, за умови ізотропного обертання зондів отримані значення 1.3 нм, 5.3 нм та 3.9 нм для пар ThT-ABM, ABM-SQ4 та SQ4-SQ1, відповідно. Ці результати свідчать про різні сайти зв’язування фібрил для зондів каскаду, хоча завдяки їх високій специфічності до фібрилярних структур, барвники мають бути локалізовані у поверхневих жолобках β-листів, що простягаються уздовж головної осі амілоїдної фібрили. Слід зауважити, що різниця у морфології амілоїдних фібрил може бути чітко охарактеризована за допомогою багатоетапного ІРПЕ. Зокрема, за даними електронної мікроскопії виявлено, що фібрили InsF2 були більш тонкими, короткими та містили аморфні агрегати, у порівнянні з InsF1. Вочевидь, різні шляхи формування амілоїдних фібрил при нейтральному та кислому значеннях рН, призвели до різної афінності зондів до сайтів зв’язування фібрил, та, як наслідок, до різних значень ефективності ІРПЕ, особливо для пари SQ4-SQ1. Здатність ThT слугувати ефективним підсилювачем для SQ4 та SQ1, що флуоресціюють у ближній інфрачервоній області, при використанні бензантронового флуорофору АВМ у якості медіатора дозволяє детектувати фібрили інсуліну в оптичному вікні біологічних зразків завдяки стоксовому зсуву чотирьох-хромофорної системи близько 240 нм. Запропонований підхід, що базується на багатоетапному ІРПЕ, можна використовувати не лише для детектування амілоїдних фібрил інсуліну, але і для диференціювання морфології фібрилярних агрегатів та встановлення механізмів розвитку ін’єкційно-локалізованого інсулінового амілоїдозу.