Трьохетапний резонансний перенос енергії в амілоїдних фібрилах інсуліну

Анотація

За допомогою системи хромофорів, що складалась із тіофлавіну T (ThT), 4-диметиламінохалкону (ДМХ) і двох сквараїнових барвників, SQ1 і SQ4, проведено оцінку можливості використання трьохетапного індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) для детектування амілоїдних фібрил інсуліну. Виявлено, що медіаторний барвник ДМХ збільшує інтенсивність флуоресценції кінцевого акцептора SQ1, що збуджується на 440 нм (у максимумі поглинання основного донора, ThT), у фібрилярному інсуліні, у порівнянні з флуоресценцією у відсутності ДМХ, що свідчить про наявність каскадного переносу енергії вздовж ланцюга ThT→ДМХ→SQ4→SQ1. Oкрім цього, Стоксовий зсув у системі з чотирма хромофорами складав 240 нм, у порівнянні з 45 нм для зв’язаного з амілоїдними фібрилами тіофлавіну Т, що свідчить про перевагу детектування амілоїдних фібрил за допомогою багатоетапного ІРПЕ завдяки вищому співвідношенню сигнал-шум. Максимальні значення ефективності переносу енергії в фібрилах інсуліну, визначені для кожної каскадної пари при вимірюванні гасіння флуоресценції донора в присутності акцептора, складали 40%, 60% і 30% для донорно-акцепторних пар ThT-ДМХ, ДМХ-SQ4 і SQ4-SQ1, відповідно, , тоді як у випадку нефібрилізованого білка перенос енергії був практично відсутній. Найбільш виражені відмінності між фібрилярним та нефібрилізованим білком спостерігались в 3D спектрах флуоресценції. Зокрема, у фібрилярних агрегатах інсуліну виявлено дві інтенсивні області з центрами на довжинах хвиль флуоресценції ~ 650 нм (SQ4) та ~ 685 нм (SQ1) при збудженні на довжині хвилі ~ 440 nm. Натомість, для нефібрилізованого білка, були наявні ледь помітні області на тих самих довжинах хвиль, а також, більш інтенсивні області при збудженні на довжині хвилі понад 550 нм, що свідчить про переважний вплив прямого збудження SQ1 та SQ4 на флуоресцентну відповідь зондів. Міжмолекулярні відстані, розраховані на основі експериментальних значень ефективності переносу енергії у припущенні ізотропного обертання хромофорів, становили 2.4, 4.5 і 3.2 нм для пар ThT-ДМХ, ДМХ-SQ4 і SQ4-SQ1, відповідно, що свідчить про різні сайти зв'язування барвників з фібрилами. Квантово-хімічні розрахунки і метод молекулярного докінгу дозволили припустити, що зв'язування SQ1, SQ4 і ThT, ДМХ відбувається з «вологою» і «сухою» поверхнями протофіламентів інсуліну, відповідно. Комплекси зонд-білок, вочевидь, стабілізуються гідрофобними, ван-дер-Ваальсовими, ароматичними та електростатичними взаємодіями. Таким чином, завдяки високій чутливості та нижчій вірогідності псевдо-позитивного результату, розроблений метод можна використовувати для детектування та характеризації амілоїдних фібрил in vitro паралельно з класичним тіофлавіновим методом. Перспективним також є використання багатоетапного ІРПЕ для візуалізації амілоїдів in vivo, за умови включення до каскаду зонду, що має смуги поглинання і флуоресценції у ближній інфрачервоній області.