Основні принципи конфокальної мікроскопії кальцієвих сигналів

В. М. Шкрыль

Анотація


Актуальність. Дослідження швидких процесів, що протікають в живих клітинах, наприклад, динаміки іонів кальцію або інших іонів, є актуальним для сучасної біофізики, фізіології та медицини і може бути виконано за допомогою лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Конфокальна мікроскопія як метод дослідження біологічних об'єктів має ряд особливостей, які потребують розуміння тонких механізмів, що лежать в її основі.

Мета роботи. Опис принципів і деталей проведення досліджень кальцієвих сигналів в живій клітині при використанні лазерної скануючої конфокальної мікроскопії з використанням флуоресцентних барвників було метою роботи.

Матеріали та методи. В роботі проведено аналіз методичних і практичних аспектів досліджень кальцієвих сигналів методом конфокальної мікроскопії.

Результати. Конфокальна мікроскопія дозволяє проводити дослідження змін концентрації вільного кальцію усередині клітини і навіть малої її частини з використанням флуоресцентного барвника, що збільшує контраст у порівнянні зі звичайною флуоресцентною мікроскопією за рахунок додаткової конфокальної апертури, розташованої перед детектором, а також використання лазерного джерела освітлення та сканування об'єкта. Для реєстрації кальцієвих сигналів необхідно провести вибір адекватних параметрів, таких як: частота реєстрації, розмір одиничного елемента сканування (пікселя), чутливість детектора, величини інтенсивності опромінення лазером, діаметр конфокальної щілини, відповідних фільтрів для збудження і випромінювання використовуваного флуоресцентного барвника та відповідного діхроічного дзеркала. Важливими етапами налаштування конфокальної системи є визначення величини функції розсіювання точки. Компенсація процесу вигорання барвника й зменшення фототоксичності, мінімізація процесу розсіювання зображення дозволяють підвищити відтворюваність експериментів.

Висновки. При використанні сучасних лазерних скануючих конфокальних мікроскопів для реєстрації кальцієвих сигналів від малої групи каналів (наприклад ріанодінових рецепторів), або частини клітини необхідно ретельно обирати параметри апаратного налаштування, які обумовлені природою об’єкта дослідження й особливостями умов експерименту. Це дозволить отримати достовірну інформацію про функціонування як окремих каналів, так і про механізми Са2+–сигналізації цілої клітини або її частини.


Ключові слова


Са2+; флуоресцентний метод; флуоресцентний барвник; конфокальна мікроскопія

Повний текст:

PDF (Russian)

Посилання


Rochefort, N. L., Jia, H., & Konnerth, A. (2008). Calcium imaging in the living brain: prospects for molecular medicine. Trends Mol Med, 14(9), 389-399. doi:10.1016/j.molmed.2008.07.005

Russell, J. T. (2011). Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol, 163(8), 1605-1625. doi:10.1111/j.1476-5381.2010.00988.x

Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., & Herman, B. (1999). Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev, 79(4), 1089-1125.

Jablonski, A. (1933). Efficiency of Anti-Stokes Fluorescence in Dyes. Nature, 131, 839-840. doi:10.1038/131839b0

Lichtman, J. W., & Conchello, J. A. (2005). Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12), 910-919. doi:10.1038/nmeth817

Yuste, R. (2005). Fluorescence microscopy today. Nature Methods, 2(12), 902-904. doi:10.1038/nmeth1205-902

Minsky M. (1961). Microscopy Apparatus: U.S. Patent #3013467A; filed Nov 7, 1957; granted Dec 19, 1961.

Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., & Sanderson, M. (2013). Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc, 2013(2), 83-99. doi:10.1101/pdb.top066050

Tsien, R. Y. (1980). New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry, 19(11), 2396-2404.

Figueroa, L., Shkryl, V. M., Blatter, L. A., & Rios, E. (2013). Using two dyes with the same fluorophore to monitor cellular calcium concentration in an extended range. PLoS One, 8(2), e55778. doi:10.1371/journal.pone.0055778

Isaeva, E. V., Shkryl, V. M., & Shirokova, N. (2005). Mitochondrial redox state and Ca2+ sparks in permeabilized mammalian skeletal muscle. J Physiol, 565(Pt 3), 855-872. doi:10.1113/jphysiol.2005.086280

Shkryl, V. M., & Shirokova, N. (2006). Transfer and tunneling of Ca2+ from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in skeletal muscle. J Biol Chem, 281(3), 1547-1554. doi:10.1074/jbc.M505024200

Shkryl, V. M., & Blatter, L. A. (2013). Ca(2+) release events in cardiac myocytes up close: insights from fast confocal imaging. PLoS One, 8(4), e61525. doi:10.1371/journal.pone.0061525

Cheng, H., Lederer, W. J., & Cannell, M. B. (1993). Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science, 262(5134), 740-744.

Rios, E., Stern, M. D., Gonzalez, A., Pizarro, G., & Shirokova, N. (1999). Calcium release flux underlying Ca2+ sparks of frog skeletal muscle. J Gen Physiol, 114(1), 31-48.

Shkryl, V. M., Blatter, L. A., & Rios, E. (2012). Properties of Ca2+ sparks revealed by four-dimensional confocal imaging of cardiac muscle. J Gen Physiol, 139(3), 189-207. doi:10.1085/jgp.201110709

Blatter, L. A., Kockskamper, J., Sheehan, K. A., Zima, A. V., Huser, J., & Lipsius, S. L. (2003). Local calcium gradients during excitation-contraction coupling and alternans in atrial myocytes. J Physiol, 546(Pt 1), 19-31.

Shtejn G.I. (2007). Rukovodstvo po konfokal'noj mikroskopiiI. (рр 19-21). INC RAN Sankt-Peterburg.

Agard, D. A., Hiraoka, Y., Shaw, P., & Sedat, J. W. (1989). Fluorescence microscopy in three dimensions. Methods Cell Biol, 30, 353-377.

Holmes F.J., O'Connor N.J. (2000). Blind deconvolution of 3D transmitted light brightfield micrographs. J Microsc., V. 200 (Pt2), 114-127.

Shaw, P. J., & Rawlins, D. J. (1991). Three-dimensional fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol, 56(3), 187-213.

Holmes, T. J., & Liu, Y. H. (1989). Richardson-Lucy/maximum likelihood image restoration algorithm for fluorescence microscopy: further testing. Appl Opt, 28(22), 4930-4938. doi:10.1364/ao.28.004930

Agard, D. A. (1984). Optical sectioning microscopy: cellular architecture in three dimensions. Annu Rev Biophys Bioeng, 13, 191-219. doi:10.1146/annurev.bb.13.060184.001203

Soeller, C., & Cannell, M. B. (2002). Estimation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ release flux underlying Ca2+ sparks. Biophys J, 82(5), 2396-2414. doi:10.1016/s0006-3495(02)75584-7


Література


Rochefort N.L., Jia H., Konnerth A. Calcium imaging in the living brain: prospects for molecular medicine // Trends Mol Med. 2008. V. 14. P. 389-399.

Russell J.T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology // Br J Pharmacol. 2011. V. 163. P. 1605-1625.

Takahashi A., Camacho P., Lechleiter J.D. [et al.] Measurement of intracellular calcium // Physiol Rev. 1999. V. 79. P. 1089-1125.

Jablonski A. Efficiency of Anti-Stokes Fluorescence in Dyes // Nature. 1933. V. 131. P. 839-840.

Lichtman J.W., Conchello J.A. Fluorescence microscopy // Nature Methods. 2005. V. 2. P. 910-919.

Yuste R. Fluorescence microscopy today // Nature Methods. 2005. V. 2. P. 902-904.

Minsky M. Microscopy Apparatus: U.S. Patent #3013467A; filed Nov 7, 1957; granted Dec 19, 1961.

Bootman M.D., Rietdorf K., Collins T. M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging // Sanderson Cold Spring Harb. Prot. 2013. № 2. P. 83-99.

Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures // Biochemistry. 1980. V. 19 (11). P. 2396-2404.

10. Figueroa L., Shkryl V.M., Blatter L.A. [et al.] Using two dyes with the same fluorophore to monitor cellular calcium concentration in an extended range // PloS One. 2013. V. 8 (2). P. e55778.

11. Isaeva E.V., Shkryl V.M., Shirokova N. Mitochondrial redox state and Ca2+ sparks in permeabilized mammalian skeletal muscle // J. Physiol. 2005. V. 565 (Pt 3). P. 855-872.

12. Shkryl V.M., Shirokova N. Transfer and tunneling of Ca2+ from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in skeletal muscle // J. Biol. Chem. 2006. V. 281 (3). P. 1547-1554.

13. Shkryl V.M., Blatter L.A. Ca(2+) release events in cardiac myocytes up close: insights from fast confocal imaging // PloS One. 2013. V. 8 (4). P. e61525.

14. Cheng H., Lederer W.J., Cannell M.B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle // Science. 1993. V. 262. P. 740-744.

15. Rios E., Stern M.D., Pizarro G. [et al.] Calcium release flux underlying Ca2+ sparks of frog skeletal muscle // J. Gen. Phys. 1999. V. 114 (1). P. 31-48.

16. Shkryl V.M., Blatter L.A., Rios E. Properties of Ca2+ sparks revealed by four-dimensional confocal imaging of cardiac muscle // Gen Physiol. 2011. V. 139. P. 189-207.

17. Blatter L.A., Kockskamper J., Sheehan K.A. [et al.] Local calcium gradients during excitation-contraction coupling and alternans in atrial myocytes // J Physiol. 2003. V. 546. P. 19-31.

18. Штеин Г.И. Руководство по конфокальной микроскопии // ИНЦ РАН Санкт-Петербург. 2007. C. 77.

19. Agard D.A., Hiraoka Y., Shaw P. [et al.] Fluorescence microscopy in three dimensions // Meth. Cell Biol. 1989. V. 30. P. 353-377.

20. Holmes F.J., O'Connor N.J. Blind deconvolution of 3D transmitted light brightfield micrographs // J Microsc. 2000. V. 200 (Pt2). P. 114-127.

21. Shaw P.J., Rawlins D.J. Three-dimensional fluorescence microscopy // Prog. Bioph. Mol. Biol. 1991. V. 56 (3). P. 187-213.

22. Holmes T.J., Liu Y.H. Richardson-Lucy/maximum likelihood image restoration algorithm for fluorescence microscopy: further testing // Appl. Optics. 1989. V. 28 (22). P. 4930-4938.

23. Agard D.A. Optical sectioning microscopy: cellular architecture in three dimensions // Ann. Rev. Bioph. Bioeng. 1984. V. 13. P. 191-219.

24. Soeller C., Cannell M.B. Estimation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ release flux underlying Ca2+ sparks // Biophys J. 2002. V. 82. P. 2396-2414.


Посилання

  • Поки немає зовнішніх посилань.


(c) 2017 В. М. Шкриль

URL ліцензії: http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/

61022, Україна, Харків, м. Свободи, 4, ХНУ імені В. Н. Каразіна, факультет радіофізики, біомедичної електроніки та комп’ютерних систем, кафедра молекулярної і медичної біофізики, к. VII-1б (7 поверх), тел.: +380 (57) 707-55-76, е-mail: biofiz-visnyk@karazin.ua