Оптична та електронна мікроскопія для візуалізації модельних циркулюючих пухлинних клітин
DOI:
https://doi.org/10.26565/2075-3810-2025-53-04Ключові слова:
клітини LLC-R9, СЕМ, КАРС, Конфокальна мікроскопія, наночастинкиАнотація
Актуальність. Мікроскопія є ключовим інструментом у біофізичних дослідженнях для візуалізації морфології, структури та динамічних процесів у живих клітинах. Залежно від конкретних задач застосовують різні методи оптичної та електронної мікроскопії, кожен з яких має свої переваги. Визначення особливостей будови цитоскелета, ядра, мембрани циркулюючих пухлинних клітин на моделі карциноми легені Льюїса (LLC) є важливою біофізичною та біологічною задачею, оскільки дозволить встановити мішені для протипухлинної та антиметастатичної терапії, а також дослідити механізми дії протипухлинних препаратів. Однак комплексне мультимодальне зображення таких клітин, особливо в умовах відсутності адгезії, залишається обмеженим у літературі через складність роботи з такими моделями.
Мета. Метою роботи було отримати зображення клітин карциноми легені Льюїса (LLC), вирощених в деадгезивних умовах, за допомогою різних методів мікроскопії. Завданням було оцінити можливості кожного методу окремо та у поєднанні для візуалізації клітинної морфології, внутрішньоклітинної структури та взаємодії з наночастинками.
Матеріали та методи. Клітини LLC були отримані з Національного банку клітинних ліній та штамів пухлин ІЕПОР НАН України та культивувалися у середовищі RPMI-1640 в умовах деадгезивного росту. Візуалізацію проводили за допомогою інверсного оптичного мікроскопа (Euromex Oxion), флуоресцентної та конфокальної мікроскопії (Carl Zeiss LSM 510) з фарбуванням F-актину (Alexa Fluor 488-фалоїдіном) і клітинних ядер (Hoechst 33342), безміткової мікроскопії когерентного антистоксового розсіювання (Leica TCS SP8), а також скануючої електронної мікроскопії (TESCAN MIRA3 LMU). 2D-MoS₂ наночастинки, а також 2D-MoS₂ і доксорубіцин одночасно, були застосовані для дослідження опосередкованого маркування наночастинками клітин та поглинання клітинами.
Результат. У цій статті представлено порівняльний аналіз різних методів візуалізації культур клітин карциноми легені Льюїса (LLC), включаючи оптичні, флуоресцентні, конфокальні, КАРС і СЕM мікроскопічні техніки. Флуоресцентна мікроскопія зі специфічними барвниками дала можливість зробити аналіз розмірів і морфології F-актинових волокон і показала, що ядра займають більшу частину деадгезивних клітин. Електронна мікроскопія виявила численні філоподії на поверхні клітин. КАРС виявив наявність ліпідних дроплетів в клітинах.
Висновки. Кожен із методів мікроскопії забезпечив унікальні та доповнюючі одна одну характеристики клітинної морфології, організації цитоскелета, вмісту ліпідів та структури мембрани. Наночастинки показали ефективність як подвійні агенти — маркери та носії препаратів. Вперше представлено докладне SEM-дослідження деадгезивних клітин LLC, що демонструє потенціал мультимодальної візуалізації для аналізу модельних циркулюючих пухлинних клітин.
Завантажити
Посилання
Zuluaga AF, Drezek R, Collier T, Lotan R, Follen M, Richards-Kortum R. Contrast agents for confocal microscopy: how simple chemicals affect confocal images of normal and cancer cells in suspension. J Biomed Opt. 2002;7(3):398–403. https://doi.org/10.1117/1.1481047
Torcellan T, Stolp J, Chtanova T. In vivo imaging sheds light on immune cell migration and function in cancer. Front Immunol. 2017:8;309. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00309
Perrin L, Bayarmagnai B, Gligorijevic B. Frontiers in intravital multiphoton microscopy of cancer. Cancer Rep. 2020;3:e1192. https://doi.org/10.1002/cnr2.1192
Hein B, Willig KI, Hell SW. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(38):14271–6. https://doi.org/10.1073/pnas.0807705105
Ali R, El-Boubbou K, Boudjelal M. An easy, fast and inexpensive method of preparing a biological specimen for scanning electron microscopy (SEM). MethodsX. 2021;8:101521. https://doi.org/10.1016/j.mex.2021.101521
Peckys DB, Mazur P, Gould KL, de Jonge N. Fully hydrated yeast cells imaged with electron microscopy. Biophys J. 2011;100(10):2522–9. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2011.03.045
Hou WL, Chang M, Liu XF, Hu LS, Hua SC. Proteomic and ultrastructural analysis of Clara cell and type II alveolar epithelial cell-type lung cancer cells. Transl Cancer Res. 2020;9(2):565–76. https://doi.org/10.21037/tcr.2019.12.04
Conchello JA, Lichtman JW. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2005;2(12):920–31. https://doi.org/10.1038/nmeth815
Cook A, Walterspiel F, Deo C. HaloTag-based reporters for fluorescence imaging and biosensing. Chembiochem. 2023;24(12):e202300022. https://doi.org/10.1002/cbic.202300022
Khodjakov A, Rieder CL. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 2006;38(1):2 16. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2005.07.007
Rubart M. Two-photon microscopy of cells and tissue. Circ Res. 2004;95(12):1154–66. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000150593.30324.42
Nahmad-Rohen A, Regan D, Masia F, McPhee C, Pope I, Langbein W, et al. Quantitative label-free imaging of lipid domains in single bilayers by hyperspectral coherent raman scattering. Anal. Chem. 2020;92(21):14657–66. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c03179
Shi J, Bera K, Mukherjee P, Alex A, Chaney EJ, Spencer-Dene B, et al. Weakly supervised identification and localization of drug fingerprints based on label-free hyperspectral CARS microscopy. Anal Chem. 2023;95(29):10957–65. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00979
Gnatyuk O, Kolesnyk D, Voitsitskyi T, Karakhim S, Nikolenko A, Dementjev A, et al. Vibrational markers of a model circulating metastatic cells LLC-R9. Spectroscopy Journal. 2024;2(4):306–21. https://doi.org/10.3390/spectroscj2040018
Dovbeshko G, Gnatyuk O, Dementjev A, Rutkauskas D, Kovalska E, Baldycheva A, et al. Coherent anti-stokes Raman scattering spectroscopy (CARS) and imaging of DNA on graphene layers and glass covers. FlatChem. 2021;27:100243. https://doi.org/10.1016/j.flatc.2021.100243
Pezacki JP, Blake JA, Danielson DC, Kennedy DC, Lyn RK, Singaravelu R. Chemical contrast for imaging living systems: molecular vibrations drive CARS microscopy. Nat Chem Biol. 2011;7:137–45. https://doi.org/10.1038/nchembio.525
Liu C, He S, Guo XF, Wang H. A novel near-infrared AIE probe for sensitive imaging of lipid droplet and dual-parameter cancer diagnosis. Anal Chim Acta. 2025;1352:343916. https://doi.org/10.1016/j.aca.2025.343916
Rashidi B, Moossa AR, Hoffman RM. Specific route mapping visualized with GFP of single-file streaming contralateral and systemic metastasis of Lewis lung carcinoma cells beginning within hours of orthotopic іmplantion. J Cell Biochem. 2013;114:1738–43. https://doi.org/10.1002/jcb.24516
Lin T, Liao Y, Chang W, Yang C, Cheng L, Cheng M, et al. The establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues. J Vis Exp. 2018;136:e56761. https://doi.org/10.3791/56761
Rask L, Fregil M, Høgdall E, Mitchelmore C, Eriksen J. Development of a metastatic fluorescent Lewis Lung carcinoma mouse model: Identification of mRNAs and microRNAs involved in tumor invasion. Gene. 2013;517(1):72–81. https://doi.org/10.1016/j.gene.2012.12.083.
Lee CB, Choi HG, Gurmessa SK, Jang IT, Kumar N, Jiang Z, et al. Enhancing antitumor immunity in Lewis lung cancer through plasma-treated medium-induced activation of dendritic cells. Cancer Cell Int. 2024;24:389. https://doi.org/10.1186/s12935-024-03569-x
Stankevicius V, Vasauskas G, Bulotiene D., Butkyte S, Jarmalaite S, Rotomskis R, et al. Gene and miRNA expression signature of Lewis lung carcinoma LLC1 cells in extracellular matrix enriched microenvironment. BMC Cancer. 2016;16:789. https://doi.org/10.1186/s12885-016-2825-9
Niu S-W, Wu C-H, Chen H-C, Yang C-J, Chang J-M, Chang EE, et al. Proteins secreted by lung сancer сells induce the onset of proteinuria via focal adhesion kinase signaling in mice. Lab Invest. 2023;103(8):100156. https://doi.org/10.1016/j.labinv.2023.100156
Pandey A, Vighetto V, Di Marzio N, Ferraro F, Hirsch M, Ferrante N, et al. Gold nanoparticles radio sensitize and reduce cell survival in Lewis lung carcinoma. Nanomaterials. 2020;10(9):1717. https://doi.org/10.3390/nano10091717
Pyaskovskaya ON, Dasyukevich OI, Kolesnik DL, Garmanchouk LV, Todor IN, Solyanik GI. Changes in VEGF level and tumor growth characteristics during lewis lung carcinoma progression towards cis-DDP resistance. Exp Oncol. 2007;29(3):197–202.
Posudievsky OYu, Khazieieva OA, Cherepanov VV, Dovbeshko GI, Shkavro AG, Koshechko VG, et al. Improved dispersant-free liquid exfoliation down to the graphene-like state of solvent-free mechanochemically delaminated bulk MoS2. J Mater Chem C. 2013;1(39):6411–5. http://doi.org/10.1039/C3TC30856A
Yoneyama H, Sudo K, Leproux P, Couderc V, Inoko A, Kano H. Invited Article: CARS molecular fingerprinting using sub-100-ps microchip laser source with fiber amplifier. APL Photonics. 2018;3:092408. https://doi.org/10.1063/1.5027006
Gnatyuk O, Dovbeshko G, Dementjev A, Chernyakova K., Posudievsky O, Kupchak, et al. Spectroscopic and microscopic evidence of 2D boron nitride nanoflake interaction with doxorubicin. Opt Mater: X. 2024;22:100323. https://doi.org/10.1016/j.omx.2024.100323
Завантаження
Опубліковано
Номер
Розділ
Ліцензія
Автори, які публікуються у цьому журналі, погоджуються з наступними умовами:
- Автори залишають за собою право на авторство своєї роботи та передають журналу право першої публікації цієї роботи на умовах ліцензії Creative Commons Attribution License, котра дозволяє іншим особам вільно розповсюджувати опубліковану роботу з обов'язковим посиланням на авторів оригінальної роботи та першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Автори мають право укладати самостійні додаткові угоди щодо неексклюзивного розповсюдження роботи у тому вигляді, в якому вона була опублікована цим журналом (наприклад, розміщувати роботу в електронному сховищі установи або публікувати у складі монографії), за умови збереження посилання на першу публікацію роботи у цьому журналі.
- Політика журналу дозволяє і заохочує розміщення авторами в мережі Інтернет (наприклад, у сховищах установ або на особистих веб-сайтах) рукопису роботи, як до подання цього рукопису до редакції, так і під час його редакційного опрацювання, оскільки це сприяє виникненню продуктивної наукової дискусії та позитивно позначається на оперативності та динаміці цитування опублікованої роботи (див. The Effect of Open Access).
